近期，国际期刊《Clinical Microbiology and Infection》发表了基于CRISPR技术的一种高灵敏性和高特异性检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA的新方法。论文题目是“Highly sensitive and specific detection of HBV DNA and drug resistance mutations utilizing the PCR-based CRISPR-Cas13a system”。该科研成果由解放军疾病预防控制中心的宋宏彬科研团队、军事医学研究院微生物流行病研究所周育森科研团队和首都医科大学附属北京佑安医院任锋科研团队共同协作完成。
临床上主要通过HBV核酸（DNA）检测和免疫学检测进行HBV感染的诊断和抗病毒疗效的监测。目前，国产 HBV DNA 检测大多都存在灵敏度低、特异性及准确性差、线性范围窄等缺陷。尤其是对于低病毒载量的患者，极易出现假阴性的结果，严重影响临床的抗病毒治疗的启动、检测抗病毒疗效的观察、CHB 特殊人群（输血、肿瘤、隐匿性感染等）病情的判断等。高灵敏度HBV DNA检测在OBI（Occult hepatitis B virus infection，OBI）筛查、术前检查、肿瘤患者放、化疗后HBV再激活风险评估、抗病毒治疗疗效与终点评价以及预测HBV表面抗原（HBeAg）阴性患者HBV耐药突变等方面表现出了突出的临床价值。虽然国外高灵敏度 HBV DNA 检测下限达到 20IU/mL 甚至更低，但从各指南可以看出，国内外专家认为，HBV DNA越早控制越好，HBV DNA水平降的越低越好。因此更高灵敏度、更高特异性的HBV DNA的方法的建立就显得尤为重要。
规律间隔性成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）/ CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。CRISPR/Cas系统介导的免疫机理：当病毒首次入侵时，细菌会将病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR间隔区；病毒再次入侵时，CRISPR转录生成一条前体CRISPR RNA（pre-crRNA），pre-crRNA被RNA内切酶切割生成含有与病毒靶标序列匹配的成熟CRISPR RNA（crRNA），该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对靶标序列进行识别和降解。2016年6月，张峰等报道了Cas13a是一种在crRNA引导下与靶标RNA特定位点结合并切割的核酸内切酶，并将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术结合，开发了一个兼具高特异性和灵敏性的酶解锁报告探针（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK）的核酸检测系统，实现了单个核酸分子的检测。2018年，张峰等发现当Cas12a特异性结合和切割目标双链DNA后，具有非特异性切割单链DNA（single strand DNA，ssDNA）的活性，并利用Cas12a的该附属切割活性开发了一个基于DNA内切酶靶向CRISPR非特异性的报告探针（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）的核酸检测系统。研究进一步证明：基于CRISPR技术可实现快速、精确、便携式的核酸诊断，其有望成为下一代核酸诊断新技术。
图1 基于CRISPR技术有望成为下一代核酸诊断新技术
本研究建立了基于CRISPR技术的PCR-CRISPR-HBV DNA检测新方法并进行了HBV DNA检测的临床验证。研究表明：PCR-CRISPR-HBV DNA新方法可以检测1个拷贝的HBV DNA，超过目前现有的荧光定量PCR检测方法。利用312例HBV患者血清标本，302例PCR-CRISPR检测结果和荧光定量PCR检测检测具有一致性，但是10例低拷贝HBV DNA能够通过PCR-CRISPR方法和数字PCR方法检测出来，而荧光定量PCR检测不出。因此基于CRISPR技术的PCR-CRISPR-HBV DNA检测新方法具有高度的灵敏性和特异性。
图2 PCR-CRISPR检测新方法可高灵敏性和高特异性检测HBV DNA
本研究还利用PCR-CRISPR-HBV DNA检测新方法对HBV YMDD核酸变异进行了检测。研究表明：利用424例HBV患者血清标本进行YMDD耐药检测，PCR-CRISPR方法、YMDD qPCR和测序方法都检测出412例耐药YMDD位点，但是对于12例耐药并且低HBV DNA载量的血清样本，PCR-CRISPR方法检测阳性，而YMDD qPCR和测序方法却没有检测出来。因此基于CRISPR技术的PCR-CRISPR的检测新方法对耐药基因检测具有显著的优越性。
图3 PCR-CRISPR检测新方法对
HBV 耐药基因YMDD变异的高灵敏性和特异性检测
综上，本研究建立了一种新型的、高灵敏性和高特异性检测HBV DNA和YMDD变异的PCR-CRISPR检测新方法，这种方法的广泛应用将为HBV感染早期发现、HBV抗病毒治疗评价和抗病毒药物的耐药监测提供重要的指导意义。
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