肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第三大原因，且大多数HCC患者在确诊时便不符合手术切除标准。免疫检查点抑制剂 (ICI)的出现彻底改变了晚期HCC患者的管理。Ⅲ期临床试验IMBrave150的研究结果显示，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗(T+A)方案可作为晚期HCC患者的一线治疗方法。

然而，其他抗PD-1治疗的随机临床试验(KEYNOTE-240和CheckMate-459)并未获得积极结果。这表明HCC复杂的免疫抑制微环境可能会驱动抗PD-1治疗耐药，但其中的机制未明。探索抗PD-1治疗耐药的机制有利于选择最适合治疗的患者以及克服免疫治疗耐药性。

中性粒细胞是人类最丰富的循环白细胞，在多种癌症类型中均有积聚。一方面，中性粒细胞可以通过释放抗肿瘤因子来抑制肿瘤进展，发挥抗肿瘤作用。另一方面，肿瘤相关中性粒细(TAN)可以诱导免疫耐受，从而促进肿瘤进展。在一些人类实体瘤中，TAN的高水平浸润会导致肿瘤进展、淋巴结转移、血管生成和不良预后。这提示TAN 在协调免疫抑制肿瘤微环境(TME)和免疫治疗耐药性中起到关键作用。

激酶样基因CT10调节因子(CRKL)是一种连接蛋白，参与介导细胞增殖、迁移、粘附、细胞骨架变化、分化、吞噬作用和病原体摄取的多种生物过程。CRKL在多种癌症中表达升高，CRKL扩增会导致癌症进展，并诱导患者对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂发生耐药。这些发现表明异常的CRKL表达在肿瘤进展中起到重要作用。

近期，复旦大学李辉、郭磊、叶青海及中国台湾中国医科大学Mien-Chie Hung教授团队于Journal of Hepatology发表了研究，发现CRKL在抗PD-1耐药的HCC组织中表达上调，并且CRKL过表达通过招募TAN和重塑肿瘤免疫微环境(TIME)而导致抗PD-1耐药，表明 CRKL是一种潜在的克服抗PD-1耐药性的靶点。

接受抗PD-1治疗的10名HCC患者的标本通过RNA测序进行基因表达鉴定。组织微阵列(TMA)包含342个HCC 样本(TMA1)和 62个HCC样本(TMA2)，通过免疫组织化学进行分析。转基因小鼠(Alb-Cre/Trp53 fl/fl)接受了腺相关病毒(AAV8)载体的流体动力尾静脉注射(HDTVi)，以过表达CRKL。使用飞行时间质谱流式细胞术(CyTOF)来分析小鼠肿瘤组织中不同免疫细胞谱系的比例和状态。

1) CRKL表达在抗PD-1耐受HCC中显著升高

为了建立抗PD-1抗体治疗耐药的小鼠模型并检查相关的关键基因，对HCC荷瘤小鼠进行长期药物治疗。尽管抗 PD-1 中和单克隆抗体(mAb)治疗最初抑制了肿瘤生长，但在5-6周的治疗过程中，三种肿瘤逐渐出现耐药性。到第8周时，三个肿瘤的大小与对照组没有显著差异。CRKL是抗PD-1耐药肿瘤组织中最显著上调的基因之一。

接下来，对32名接受抗PD-1治疗的不可切除HCC患者接受抗PD-1治疗进行了研究。选择五名有反应者和五名无反应者的治疗中肿瘤组织进行测序。与小鼠的测序结果相比，CRKL是无应答者肿瘤组织中前100个上调基因中唯一重叠的基因。鉴于癌症免疫治疗主要依赖于TIME中T细胞的浸润，进一步分析了CRKL在HCC组织中的表达及其与CD8+T淋巴细胞浸润的关系。与应答者相比，在非应答者样本中观察到CRKL高表达，而CD8+免疫细胞的浸润减少。因此，CRKL可能是与抗PD-1耐受相关的关键基因。

2) CRKL水平升高与HCC患者预后不良以及CD8+T细胞浸润减少相关

为了研究 CRKL 的致癌作用，通过免疫组织化学(IHC)评估了CRKL表达在HCC中的临床相关性。在接受根治性切除的 42 名HCC 患者的TMA1 中，观察到高CRKL表达和较少的CD8+T淋巴细胞浸润与HCC患者较差的总生存期(OS)和高复发率相关。

3) CRKL上调降低抗PD-1治疗的疗效并抑制小鼠肿瘤中CD8+T细胞的浸润和功能

使用免疫活性小鼠，建立了原位HCC小鼠模型，该模型携带由CRKL过表达或对照细胞形成的肝肿瘤，并使用抗PD-1 mAb或IgG2a治疗小鼠。肿瘤切片的免疫荧光染色显示，无论是否进行抗PD-1治疗，CRKL过表达组中CD8+T细胞均大幅减少。此外，流式细胞术结果表明，CRKL过表达组中CD8+T细胞的浸润和活性显著降低。在自发性 HCC 的 Alb-Cre/Trp53 fl/fl小鼠模型中也观察到类似结果。

4) CRKL过度表达通过招募TAN影响免疫微环境

CRKL过表达组小鼠有更多的肝肿瘤结节和更大的肿瘤，且肿瘤浸润中性粒细胞的数量显著增加，而CD8+T细胞的数量减少。PD-L1+  TAN在CRKL过表达的肿瘤组织中显著上调。PD-L1+ TAN 通过抑制T细胞免疫在肿瘤中发挥免疫抑制作用，并且与癌症患者的不良预后相关。CRKL过表达组中活化的CD8+T细胞的比例减少，而耗尽的CD8+T细胞的比例增加。当用抗Ly6G抗体治疗小鼠使其体内的TAN被特异性消除时，CRKL诱导的肿瘤生长被逆转，同时CD8+T细胞浸润增加。

5) VEGFα 和 CXCL1 对于CRKL引发的肿瘤中TAN浸润是不可或缺的

据报道，VEGFα和CXCL1会影响多种免疫群体，例如T细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞。为了进一步证实VEGFα和CXCL1是否对于CRKL引发的HCC中TAN上调至关重要，我们采用了 CXCR2/1抑制剂SX-517和 VEGFα 抑制剂贝伐珠单抗刺激HCC细胞系。

结果显示HCC细胞系中VEGFα和CXCR2/1的阻断逆转了CRKL过表达对中性粒细胞迁移的促进，降低了PD-L1+ TAN的比例。这表明CRKL可以通过VEGFα和CXCL1调节TAN的PD-L1表达。

6) CRKL通过与β-catenin相互作用调节VEGFα和CXCL1表达

CRKL 过表达显著升高了HCC细胞系中β-catenin的蛋白水平，增强了细胞核和细胞质中 β-catenin 的活性。抑制了CRKL过表达HCC细胞系中的β-catenin表达后，VEGFα和CXCL1的上调也被逆转。

7) CRKL通过与Axin1竞争来减弱β-catenin的蛋白酶体降解

中心支架蛋白轴抑制蛋白1(Axin1)是Wnt/β-连环蛋白级联的重要负调节因子，可直接结合和组装核心破坏复合物的所有组件，以促进 β-catenin的蛋白酶体降解。

CRKL升高以剂量依赖性方式降低β-catenin和Axin1之间的相互作用，并且Axin1过表达对CRKL和β-catenin相互作用具有相同的抑制作用。Wnt/β-catenin通路抑制剂 XAV-939 通过减少ly6G+中性粒细胞的浸润并增强其活性和浸润，有效恢复了因 CRKL过表达而阻断的抗PD-1 治疗的疗效。

8) CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1轴的激活产生免疫抑制性TME

为了进一步验证临床HCC组织中已确定的CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1 轴，通过TMA2的IHC检测了62 名 HCC 患者的CRKL、β-catenin、VEGFα 和 CXCL1表达。CRKL、β-catenin、VEGFα和CXCL1表达之间呈正相关。TMA2中过度激活的CRKL/β-连环蛋白/VEGFα和CXCL1轴导致CD8+T细胞浸润减少和CD66b+中性粒细胞浸润上调。CRKL/β-catenin/VEGFα 和CXCL1轴的激活可能通过产生免疫抑制性 TME导致抗PD-1治疗效果不佳。

9) 基于CRISPR/Cas9的CRKL基因缺失或CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1轴阻断可提高抗 PD-1 治疗的疗效

我们从三名 CRKL过度表达的HCC患者的肿瘤样本中获得了患者来源的器官型肿瘤球体(PDOTS)。Wnt/β-连环蛋白抑制剂XAV939、VEGFα抑制剂贝伐珠单抗和多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKI)可以有效恢复抗PD-1治疗的疗效，阻断CRKL/β-catenin/VEGFα 和CXCL1轴可以改善抗PD-1耐药性。

CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1轴的激活是成功抗PD-1治疗的关键障碍。因此，CRKL抑制剂联合抗PD-1可能被开发用于HCC的治疗。

本研究发现CRKL在抗PD-1耐药性HCC中过度表达，并且CRKL上调促进HCC中的抗PD-1 耐药性。CRKL/β-catenin/VEGFα 和CXCL1轴上调通过促进肿瘤相关中性粒细胞(TAN)浸润而促进抗PD-1耐药。这些发现支持了基于贝伐珠单抗的ICIs联合治疗策略，CRKL抑制剂联合抗PD-1疗法可能被开发用于HCC的治疗。

文献索引：Xie P, Yu M, Zhang B, Yu Q, Zhao Y, Wu M, Jin L, Yan J, Zhou B, Liu S, Li X, Zhou C, Zhu X, Huang C, Xu Y, Xiao Y, Zhou J, Fan J, Hung M C, Ye Q, Guo L, Li H. Crkl Dictates Anti-Pd-1 Resistance by Mediating Tumor-Associated Neutrophil  Infiltration in Hepatocellular Carcinoma[J]. Journal of Hepatology, 2024.